Калькулятор температуры плавления праймера (Tm)
Введите последовательность праймера, чтобы оценить его температуру плавления. Для праймеров короче 14 нуклеотидов применяется правило Уоллеса, для более длинных — базовая формула по GC-составу; показываются оба значения, GC-состав и число оснований.
Работает в браузере: всё, что вы вводите, никуда не отправляется.
Как пользоваться
- Введите или вставьте праймер в направлении 5′ → 3′. Регистр, пробелы и номера позиций не важны.
- Смотрите температуру плавления и формулу, по которой она получена.
- Сравните прямой и обратный праймеры: их Tm должны быть близки, обычно в пределах нескольких градусов.
Формулы
- Правило Уоллеса (длина N < 14): Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C) °C.
- Базовая формула по GC (N ≥ 14): Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ N °C.
GC-состав = (G + C) ÷ N × 100 %.
Пример
Праймер по умолчанию AGCGGATAACAATTTCACACAGGA — 24 основания: A 10, T 4, G 5, C 5, то есть G + C = 10. Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) ÷ 24 = 64,9 − 10,93 = 53,97, на экране — 54 °C. GC-состав — 41,7 %. Правило Уоллеса дало бы 2 × 14 + 4 × 10 = 68 °C — слишком много для 24-мера, поэтому его применяют только к коротким олигонуклеотидам.
10-мер ATGCATGCAT (A 3, T 3, G 2, C 2): 2 × 6 + 4 × 4 = 28 °C по правилу Уоллеса.
Советы
- Обычно подбирают праймеры длиной около 18–25 нт с GC-составом около 40–60 % и разницей Tm в паре не больше нескольких градусов.
- Избегайте повторов из четырёх и более одинаковых оснований и комплементарных друг другу 3′-концов праймеров.
- Для второго праймера пары пригодится калькулятор обратно-комплементарной последовательности.
Частые вопросы
По какой формуле считает калькулятор?
Для праймеров короче 14 нуклеотидов — по правилу Уоллеса: Tm = 2 °C × (A + T) + 4 °C × (G + C). Начиная с 14 нуклеотидов — по базовой формуле Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ N, где N — длина. В строке результата указано, какая формула применена; оба значения тоже показаны.
Насколько точна эта Tm?
Это грубая оценка. Ни одна из формул не учитывает концентрацию солей и Mg²⁺, концентрацию праймера и влияние соседних оснований, которое учитывают модели ближайших соседей, поэтому значения из программ подбора праймеров или калькулятора производителя полимеразы могут отличаться на несколько градусов.
Какую температуру отжига выбрать?
Часто начинают примерно на 3–5 °C ниже меньшей из Tm пары праймеров и подбирают точнее градиентной ПЦР. Ориентируйтесь на рекомендации производителя полимеразы — у него бывает свой метод расчёта Tm.
Почему не принимаются вырожденные основания?
Вырожденная позиция (N, R, Y …) может оказаться и прочной парой G–C, и слабой A–T, поэтому одна Tm по формуле не получится. Посчитайте Tm для крайних вариантов.