Calculadora de temperatura de fusión (Tm) de cebadores
Escribe la secuencia de un cebador para estimar su temperatura de fusión. Los cebadores de menos de 14 nucleótidos usan la regla de Wallace y los más largos, la fórmula básica de contenido GC; se muestran ambos valores, el contenido GC y el número de cada base.
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Cómo se usa
- Escribe o pega el cebador de 5′ a 3′. Mayúsculas, minúsculas, espacios y números de posición dan igual.
- Lee la temperatura de fusión y qué fórmula la dio.
- Compara el cebador directo y el reverso: sus Tm deberían ser parecidas, normalmente a pocos grados.
Fórmulas
- Regla de Wallace (longitud N < 14): Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C) °C.
- Fórmula básica de GC (N ≥ 14): Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ N °C.
Contenido GC = (G + C) ÷ N × 100 %.
Ejemplo
El cebador por defecto AGCGGATAACAATTTCACACAGGA tiene 24 bases: A 10, T 4, G 5, C 5, así que G + C = 10. Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) ÷ 24 = 64,9 − 10,93 = 53,97, que se muestra como 54 °C. El contenido GC es 41,7 %. La regla de Wallace daría 2 × 14 + 4 × 10 = 68 °C, demasiado para un 24-mero; por eso solo se usa en oligos cortos.
Un 10-mero ATGCATGCAT (A 3, T 3, G 2, C 2): 2 × 6 + 4 × 4 = 28 °C por la regla de Wallace.
Consejos
- Busca cebadores de unos 18–25 nt, con un contenido GC de alrededor del 40–60 % y Tm de la pareja a pocos grados entre sí.
- Evita series de cuatro o más bases iguales y extremos 3′ complementarios entre los dos cebadores.
- Para el segundo cebador de la pareja, la herramienta de reverso complementario convierte la secuencia diana en el cebador que hay que pedir.
Preguntas frecuentes
¿Qué fórmula usa la calculadora?
Para cebadores de menos de 14 nucleótidos, la regla de Wallace: Tm = 2 °C × (A + T) + 4 °C × (G + C). Desde 14 nucleótidos, la fórmula básica Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ N, donde N es la longitud. El resultado indica cuál se aplicó y muestra los dos valores.
¿Qué precisión tiene esta Tm?
Es una estimación aproximada. Ninguna de las fórmulas tiene en cuenta la concentración de sales o de Mg²⁺, la del cebador ni el efecto de las bases vecinas que incluyen los modelos de vecinos más cercanos, así que los programas de diseño o la calculadora del fabricante de la polimerasa pueden dar varios grados de diferencia.
¿Qué temperatura de hibridación uso?
Un punto de partida habitual es unos 3–5 °C por debajo de la Tm más baja de la pareja de cebadores, y luego ajustar con una PCR en gradiente. Sigue la recomendación del fabricante de tu polimerasa, que a menudo usa su propio método de Tm.
¿Por qué no se aceptan bases ambiguas?
Una posición degenerada (N, R, Y…) puede ser un par G–C fuerte o un par A–T débil, así que las fórmulas no dan una única Tm. Calcula la Tm de las variantes extremas.