Поиск сайтов рестрикции
Вставьте последовательность ДНК и посмотрите все распространенные ферменты, которые ее режут, сколько раз и где. Или выберите один фермент, чтобы получить размеры фрагментов и тип концов. Кольцевые плазмиды проверяются и через стык конца последовательности с ее началом.
Работает в браузере: всё, что вы вводите, никуда не отправляется.
Как пользоваться
- Вставьте последовательность ДНК. Подходят FASTA и текст с номерами в стиле GenBank.
- Выберите линейную или кольцевую ДНК.
- Оставьте «Все ферменты», чтобы увидеть каждый разрезающий фермент с позициями, ферменты с единственным сайтом и те, что не режут. Или выберите один фермент — для фрагментов и типа концов.
Как это работает
Каждый сайт в списке — палиндром: он одинаково читается на обеих цепях в направлении 5′ → 3′, поэтому одного поиска по верхней цепи достаточно. Для каждого совпадения место разреза — начало сайта плюс смещение фермента (у EcoRI — 1). В режиме кольца конец последовательности соединяется с началом, и сайт на стыке тоже находится. Фрагменты — расстояния между соседними разрезами.
Пример
В AAGAATTCAAGAATTCAA (18 п. н.) GAATTC стоит на позициях 3–8 и 11–16. EcoRI режет после нуклеотидов 3 и 11. Для линейной ДНК программа выводит фрагменты 8; 7; 3 bp, для кольцевой — 10; 8 bp (bp — пары нуклеотидов, п. н.).
Последовательность по умолчанию устроена как полилинкер плазмиды: ее режут 17 ферментов, среди них с единственным сайтом BamHI (после 37), HindIII (7), PstI (23), SalI (25), XbaI (31), KpnI (50) и SacI (56).
Советы
- Единственный сайт — для клонирования. Фермент, который режет плазмиду один раз внутри полилинкера, раскрывает ее, не вырезая кусок.
- Совместимые концы. BamHI, BglII и MboI оставляют выступы GATC, которые можно лигировать друг с другом.
- Сайт у самого конца. Многие ферменты плохо режут, если сайт всего в нескольких нуклеотидах от конца ПЦР-продукта; добавляйте к праймерам лишние нуклеотиды.
Частые вопросы
Какие ферменты включены?
41 широко используемая рестриктаза II типа с палиндромным сайтом узнавания без вырожденных оснований, от AatII до XmaI, в том числе EcoRI, BamHI, HindIII, NotI, XhoI, NdeI и «четырехщепящие» AluI, HaeIII, MspI, TaqI, RsaI и MboI. Сайты и места разрезов — по REBASE и NEB.
Что значит запись G^AATTC?
Знак ^ показывает, где фермент разрезает верхнюю цепь: EcoRI режет между G и A. Сайт — палиндром, поэтому нижняя цепь разрезается в зеркальном месте, и на каждом 5′-конце остается выступ AATT из четырех нуклеотидов.
Почему SmaI и XmaI дают разные позиции для одного сайта?
Это неошизомеры: оба узнают CCCGGG, но SmaI режет посередине (CCC^GGG, тупые концы), а XmaI — после первого нуклеотида (C^CCGGG, 5′-выступы). Программа показывает, где режет каждый.
Как считаются фрагменты кольцевой плазмиды?
Кольцо, разрезанное n раз, дает n фрагментов; последний идет через стык от последнего разреза к первому. Один разрез просто раскрывает кольцо в линейную молекулу полной длины. Линейная молекула при n разрезах дает n + 1 фрагмент.
Учитывается ли метилирование?
Нет. Часть сайтов блокируется метилированием Dam или Dcm в ДНК из распространенных штаммов E. coli (например, MboI не режет Dam-метилированный GATC). Проверьте чувствительность фермента, прежде чем планировать рестрикцию.